从灵长类动物大脑中获取大量单个神经元的生物电信号仍然具有挑战性。慢性植入电极能提供合理的通道数量（约100个），但仅能对皮层的一小块固定区域进行采样。急性插入电极可通过每日进行新的穿刺来对更广泛的区域进行采样。本研究旨在开发一种主动式密集CMOS探针和实验方法，以实现在行为猴身上进行大规模急性单单元记录。专门设计了一种用于皮层内猕猴记录的单柄CMOS探针。该设备基于SiNAPS技术，并增加了多路复用电路以最大限度减少输出线路。使用多探针系统实现了超过2000个电极像素以每通道20 kHz的同步采样。在行为猕猴的运动皮层进行了实验，实现了多日插入。研究人员开发了方法来提取经逆向激活识别的神经元的自发放电时间。该探针（长10.7毫米，宽158微米，厚50微米）提供了1024个电极（14 x 14 平方微米）的规则阵列，这些电极排列成4列，电极间距为30微米。通过一个小的先导孔便于硬脑膜穿刺；优化的插入程序允许从许多不同位点进行记录。一些细胞通过逆向激活被识别为锥体束神经元，这些神经元投射到脊髓。这种探针配置能够到达中央沟的前壁，该区域包含许多直接连接到运动神经元的皮质脊髓细胞。意义：这项研究是灵长类神经生理学工具包的一项重要进展。
一、介绍
近年来，非人灵长类动物（尤其是猕猴）大规模单细胞分辨率神经记录技术取得了显著进展。传统微丝阵列虽已实现超过1000个隔离单元的长期记录研究，但使用低通道数植入体在不同脑区进行记录通常需要多次实验。相比之下，近期基于CMOS的高密度神经探针每次实验即可获得相当甚至更高的记录效率。此外，采用多探针系统能够同时监测多个脑区，进一步提升单单元记录总量，为局部和分布式脑环路的精细电生理与连接研究提供支持。
展开剩余93%最初为啮齿类研究开发的Neuropixels探针现已适配非人灵长类应用，实现高密度大规模单神经元分辨率记录。Neuropixels 1.0及其非人灵长类版本可分别从960个、2496个或4416个电极位点中选择384个通道进行记录。通过多探针配置已实现超过1000个神经元的同步记录，该技术正日益应用于猕猴认知与感觉神经科学研究。典型案例如Triple-N数据集，利用Neuropixels探针在猕猴被动观看千张自然图像时记录颞下皮层27个子区域，为视觉处理及跨物种比较研究提供了宝贵资源。
新近问世的NeuroScroll探针拥有1024个通道，探针长度10-90毫米可调，已在非人灵长类实现长达105周的稳定慢性记录。但与Neuropixels不同，该探针需外接CMOS放大器和信号调理电路，导致组装复杂度增加并带来操作挑战。
尽管取得这些进展，要实现大规模分布式单神经元生物电信号的可靠采集仍需进一步突破。这对揭示脑功能执行机制至关重要：例如运动皮层通过计算激活序列调控特定动作，而该区域的多单单元记录对解析这些计算本质具有巨大潜力。通过识别向皮层下中枢传递输出的神经元可获得重要线索，其中最关键的输出神经元是皮质脊髓细胞，其长轴突经延髓锥体束投射至脊髓，最终通过运动神经元传递所有运动指令。
锥体束神经元可通过逆向刺激精准识别：在延髓锥体束植入刺激电极，当皮层记录到最低阈值逆向场电位时确定电极位置。后续实验中，锥体束神经元会对刺激产生逆向放电。确认逆向放电需满足三个标准：时间抖动低于0.1毫秒；在窄刺激强度范围内出现全或无响应；与自发放电发生碰撞抑制现象。
为提升分布式单神经元识别能力，本研究基于SiNAPS技术开发了新型高通道数CMOS探针系统，专门用于清醒行为猴运动皮层记录（图1）。实现的SiNAPS-NHP探针通过紧凑I/O接口支持1024个电极通道连续采样，以每通道20千赫兹速率传输实时宽带电生理数据，采集系统可扩展至2048通道。为克服犹他阵列等慢性植入体的局限，我们建立了经硬脑膜重复急性插入方案，实现每日针对不同皮层位点的记录，显著提升了记录的空间覆盖范围与灵活性。
图1. 1024通道SiNAPS-NHP探针概览。（A）猕猴多探针记录示意图，包含实探针视图、像素级模拟前端（AFE）结构图、探针上的时分复用（TDM）电路及二级复用（MUX）电路示意图。（B）使用两套SiNAPS-NHP探针系统进行2048个电极通道同步记录的方案与控制信号时序图。
二、方法
01.CMOS探针设计与实现
基于SiNAPS电路架构，我们开发了一款单柄高密度CMOS神经探针，具备1024个电极通道。该架构此前已在体内神经记录中验证其有效性。本次设计改进了电极像素布局，并通过增加复用电路将信号输出线数量减半，从而简化了在窄版印刷电路板上的集成（图1A）。
东莞市富临塑胶原料有限公司是Neuropixels中国代理商，为中国客户提供Neuropixels数据采集系统、神经探针。
探针在细长柄上集成多个功能模块。每个模块包含32个电极像素传感器，每个像素由一个14×14 µm²（位于CMOS顶层金属）的金属电极垫用于神经信号检测，以及底层信号放大和调理电路构成。与先前SiNAPS设计一致，每个像素采用直流耦合模拟前端，包含一个两级低噪声放大器和周期性使能的反馈环路，以管理电极-组织界面的直流偏移（图1A）。放大器主要工作于开环模式，周期性激活的自动归零环路会动态调整第一级偏置电流，以稳定直流工作点。
为优化数据路由，每个模块采用32:1时分复用方案，缓冲输出信号传输至探针基部。本设计中主放大器提供40 dB交流增益，并集成截止频率为4 kHz的一阶低通滤波器，以抑制TDM流中的混叠效应。不同于以往每个模块独立输出pad的设计，此次在探针基部实现了双倍数据速率读出方案。记录区由2×16个功能模块沿探针柄排列，形成4×256电极像素阵列，电极间距30 µm，总计1024通道。该布局在保持紧凑截面适于植入的同时，扩展了横向观测视野。
探针采用标准180 nm CMOS工艺制造，并通过调整已有工艺进行后处理以定型探针形状和电极材料。通过CMOS基底微加工技术，实现探针柄尺寸为158 µm × 10.7 mm（电极覆盖活性区7.77 × 0.107 mm²），基部尺寸为328 µm × 5.2 mm。此外，通过铂剥离工艺将CMOS绝缘层原生10×10 µm²开口（暴露铝铜合金顶层金属）图案化为14×14 µm²铂电极。利用同一剥离步骤，在电极旁集成制作了铂伪参考电极（图2B和2E特写）。通过背面研磨将SiNAPS-NHP探针厚度控制在50 µm。图2展示了实际器件的扫描电镜照片。经初步原型实验验证后，SiNAPS-NHP探针实现晶圆级制造。
图2. 制备的SiNAPS-NHP有源神经探针的扫描电镜照片。该器件采用极窄基部设计以便实验操作。（A）探针基部顶端及输入/输出焊盘。（B）探针基部与柄部连接界面，显示集成参考电极输入/输出焊盘。（C）显示活性区域起始段的探针柄部。（D）探针尖端。（E）带集成参考电极的探针尖端特写。（F）电极像素单元的特写视图。
随后将探针安装于窄版PCB（宽6毫米，厚1毫米，长5厘米）并进行引线键合。PCB布局经过优化以实现灵活定位，既能覆盖颅骨腔内暴露骨窗的任何位点，又可选择性使用集成伪参考电极。接着通过电沉积技术在电极上镀铂以降低电化学阻抗，从而减少相关噪声。电沉积使用电位stat/电流stat（PGSTAT204，瑞士万通）配合三电极电化学池进行：Ag/AgCl参比电极、铂对电极，探针所有微电极并联作为工作电极。沉积前先用0.5 mol/L硫酸通过循环伏安法清洗铂微电极以确保均匀性，随后更换为"Platinum AP + 4G/L Pt"电镀液，以每个电极10 nA恒定平均电流沉积1小时。
02. 数据采集系统
数据采集平台以Altera Cyclone IV FPGA开发板为核心，集成12位高速低功耗SAR ADC。系统包含从5V输入生成稳定低噪声电源的电源管理电路。FPGA负责时分复用数据读出与数字化（每电极像素20 kHz，12位），并运行定制实时数字处理单元控制探针操作。与标准SiNAPS探针每32电极模块单通道输出不同，SiNAPS-NHP探针采用双倍数据速率传输，可在相同时隙传输两个样本。数字处理单元还实现流水线式实时二阶IIR滤波器，具备可编程高通截止频率（2 Hz或300 Hz）及固定5 kHz低通截止频率。为实现实时PC交互，FPGA支持通过CameraLink传输高速数据（原始与处理数据），并通过UART进行低速命令控制。
图3. 电沉积铂微电极的电化学阻抗谱。1 kHz频率下的平均阻抗模值为每电极858 ± 125.7 kΩ（检测样本量：5支探针 × 1024个电极）。
采用两套同步数据采集系统（图1B）对两支SiNAPS-NHP探针的2048个电极通道进行同步采集。如前所述，每个采集系统以帧为单位获取数据，每帧包含通过时分复用和双倍数据速率方案读出的1024个通道。帧起始由20 kHz公共采样脉冲信号的上升沿定义，该脉冲由主系统通过图形用户界面激活后产生。主系统首先启动数据采集，随后将同一采样脉冲发送至从系统，从系统通过置位从机就绪信号并启动自身采集作为响应。由于两系统共享同一采样脉冲，其帧采集实现本质同步。此外，主系统生成并由两系统共同记录的同步触发信号，用于离线处理时精确对齐双数据流。每套采集系统通过1米长50芯电缆连接对应探针，电缆远端集成紧凑电路板，确保1.8V标称电源与公共参考偏置电压的低噪声传输。
03.手术植入
迄今已在五只猕猴（两只雄性，体重6.4-12.7公斤）完成实验记录。所有动物先在接受全身麻醉（2-3%七氟烷吸入）下进行MRI扫描，生成颅骨三维模型用于设计环形头件植入体。该头件贴合颅骨曲面，内置覆盖初级运动皮层和背侧前运动皮层的记录腔室（内尺寸18×18 mm²）。最终设计采用钛合金3D打印并经羟基磷灰石涂层处理以促进骨整合。在全身麻醉（2-3%七氟烷吸入配合12 μg/kg/小时阿芬太尼静脉输注）下，通过扩展头螺栓系统将头件牢固固定于颅骨。同期植入12路臂部肌电电极，导线经皮下隧道连接至头件接口。术后恢复期，在麻醉下通过二次简短手术打开记录腔室骨窗，为每日脑内穿刺提供通道。该次手术中还于延髓锥体束植入两根聚对二甲烯绝缘钨丝电极用于刺激。
04.预处理与数据分析
采用MATLAB自定义应用SpikeLAB进行数据预处理，提供时频域可视化、滤波、坏道识别、公共平均参考和单单元排序等功能。本研究在动作电位频带进行滤波，并通过SpikeLAB调用开源Kilosort算法进行单元排序。未进行人工校正，但设置最低平均放电频率阈值。最终提取三项记录质量指标：各通道信号均方根值、掩蔽通道数量及单元总数。
05.逆向激活识别实验流程
当探针插入皮层目标位点后，首先记录锥体束刺激响应（固定刺激强度500 μA，确保覆盖多数锥体束神经元阈值）。刺激采用双相电荷平衡脉冲（每相0.1 ms宽度），以0.5-0.7秒间隔施加，持续记录两分钟。随后关闭刺激，记录行为任务期间的自发活动（约一小时）。实验结束时再次进行两分钟锥体束刺激响应记录。
为增强场电位与逆向放电响应的视觉区分度，按以下方法计算重参考响应x'：
其中 _i_ 为通道编号，_t_ 为记录时间，_x_ 为原始记录数据。由于SiNAPS-NHP探针具有四列接触点，16个通道的偏移量等效于从每个信号中减去上方四行与下方四行通道的平均值。我们推测场电位随深度缓慢变化，而锥体束神经元的放电应具有严格受限的空间范围。因此，放电信号在 _x'_ 中应比在 _x_ 中更清晰可辨。
通常，脉冲排序以盲源分离方式进行——先检测记录中包含的不同神经元数量，再进行脉冲分离与分类。而识别特定锥体束神经元的方法有所不同，因为我们可从逆向响应中先验地获知目标脉冲波形（此处为多通道波形）。我们通过生成多维滤波器解决此类脉冲的识别问题，该滤波器可对数据进行扫描以重建脉冲序列。我们通过假设存在基础脉冲序列 _S(t)_ 对数据进行建模（若 _t_ 时刻出现脉冲则 _S(t)=1_，否则为0；_t_ 为离散时间，对应采样点编号）。若向量 _x<sub>i</sub>(t)_ 表示探针第 _i=1…M_ 通道的信号，我们将其扩展 _K_ 倍，使新的 _MK × 1_ 维向量 _X(t)_ 包含所有 _M_ 个通道从 _t_ 时刻前溯 _K_ 个延迟采样的数据：
假设检测到的少量自发放电的出现时间为 _t<sub>j</sub>_（_j=1..J_），则以前述扩展向量格式表示的平均放电波形为：
记录数据的协方差矩阵定义为：
其中 E(•) 表示期望算子。脉冲滤波器计算公式为：
脉冲序列 _S(t)_ 的估计值由以下公式给出：
三、结果
01.SiNAPS-NHP探针性能表征
电极阻抗（图3）在0.9% NaCl溶液中通过铂电沉积装置测量。由于无法单独测量各微电极，单电极阻抗通过测量总阻抗模值乘以电极总数估算，得出单电极在1 kHz频率下阻抗为858 ± 126 kΩ（样本量：5支探针 × 1024电极/探针）。
采用铂丝溶液接地法在盐水中评估均方根噪声（样本量：5支探针 × 1024电极）。测得噪声值为：全频带[0.1-5000 Hz]为22.3 ± 6.4 µV<sub>RMS</sub>，局部场电位频带[0.1-300 Hz]为19.2 ± 7.2 µV<sub>RMS</sub>，动作电位频带[300-5000 Hz]为10.5 ± 1.4 µV<sub>RMS</sub>。
图4. 记录腔室及穿刺流程照片。（A）暴露硬脑膜的腔室视图。（B）置于腔室定位标记上海绵胶泡沫块上的SiNAPS-NHP探针。（C）置于硬脑膜预定穿刺位点的30G针头。（D）穿刺硬脑膜后的SiNAPS-NHP探针。（E）到达记录终末深度的SiNAPS-NHP探针。（F）从皮层取出后的SiNAPS-NHP探针。
02.SiNAPS-NHP探针在猕猴皮层的穿刺技术
在清醒行为猴中应用SiNAPS-NHP探针需攻克多项技术难点。首要挑战是连接硅探针的印刷电路板在记录腔室内会占用空间，限制探针靠近腔室边缘穿刺。因此将PCB宽度严格控制在6毫米，并采用低剖面记录腔室设计以实现穿刺过程可视化。
硬脑膜穿刺是另一难题。骨窗暴露的硬脑膜会快速增生变厚，通过每日使用抗增殖药物5-氟尿嘧啶配合精细护理可维持薄膜状态。但即使如此，探针仍难以直接穿刺。为此我们开发了立体定位穿刺方案：将探针以30度倾角安装于微驱系统，通过止血海绵垫片缓冲接触压力（图4B）。先用手持30G针头在预定靶点穿刺硬脑膜（图4C），该方式较机械穿刺更能避免深层组织损伤。随后探针沿穿刺孔插入皮层（图4D），深度控制1-1.5毫米。研究发现穿刺失败多因蛛网膜未穿透所致，二次针穿刺可有效解决。
此方法通过立体定位坐标计算、可视化接触判断及手动针穿刺协同，实现了高成功率皮层穿刺，为长期急性实验奠定了基础。图4中硬脑膜上的微小疤痕即为多次成功穿刺的见证。
图5. 双SiNAPS-NHP探针在猕猴运动皮层同步记录2048个电极通道的示例。信号经动作电位频带（300 Hz至5 kHz）滤波并执行公共平均参考。探针1有35个坏道（即未处于正确工作点），探针2有21个坏道被掩蔽。（A）展示5毫秒时间窗口内各通道的均方根值。（B）呈现通过Kilosort-3提取的单单元模板（平均放电频率≥0.1次/秒），探针1识别587个单元，探针2识别725个单元。每个探针有三个示例单元用红色高亮。（C）为各探针四列电极（C1-4）记录信号的局部放大图，黑色方框标示（B）中确定的示例单元。（D）展示（B）和（C）中示例单元的波形模板与自相关图。
随后使用微驱以5-10微米/秒的慢速将探针推进至目标记录深度。缓慢推进能提高细胞捕获率并减少记录过程中的信号漂移。当记录猕猴初级运动皮层表面亚区时，探针通常仅需推进1.5-3毫米（图4E）；当进入中央沟内的M1区域时，可充分利用探针全长推进7.7毫米。
当探针到达目标深度后，在猴子执行行为任务时开始记录。任务执行通过单/多通道力传感器（3只猴）或高速视频（2只猴）监测。所有模拟/数字任务信号、12路肌电信号及1024通道探针信号均通过Intan RHD2000系统与SiNAPS采集设备并行记录。通过双向设备同步采集任务事件数字脉冲实现离线信号对齐。部分实验中同时植入两支SiNAPS-NHP探针，通过记录相同任务事件实现多数据流同步。
上述流程使探针破损率显著降低，单支探针可重复使用多次。
03.电生理记录结果
数据经300 Hz-5 kHz带通滤波、坏道掩蔽及公共平均参考处理后，通过Kilosort3以0.1次/秒为阈值进行单单元检测。探针1有35个坏道，探针2有21个坏道被掩蔽。图5A显示5毫秒神经活动窗口内的通道均方根值，较高值对应较强放电活动。图5B展示放电超阈值的单单元模板（探针1587个，探针2725个），其中三个示例单元用红色标出。图5C为高均方根值区域动作电位信号的局部放大，黑色方框标示示例单元对应信号。图5D呈现示例单元的波形模板与自相关图。
04.锥体束神经元逆向激活识别
离线分析首先编译各通道对锥体束刺激的平均响应，并以伪彩图显示（图6A）。刺激伪迹后可见场电位响应，但难以从中分辨逆向放电。经重参考处理后，空间梯度较浅的成分被移除，多个响应清晰显现（图6B）。黑色方框标示的响应在图6后续部分详细展示：原始数据中场电位与放电重叠混淆（图6C），而重参考数据清晰揭示放电波形（图6D）。
图6E-F展示最大响应通道（图6D中*标示）的单次扫描叠加结果。通过sinc函数重构20 kHz采样数据后，可见大多数扫描中存在明确响应（图6E），但15/202次扫描因自发放电导致碰撞而无响应（图6F红色轨迹为响应平均波形）。图6G显示响应峰值潜伏期的直方图，27微秒的极低抖动符合逆向响应特征。
为检测锥体束神经元自发放电时间，首先在记录初期通过阈值检测获取少量自发放电，并手动设置电压窗口筛选与逆向放电波形相似的脉冲。图7A显示同一细胞的逆向放电（红色）与自发放电（黑色）平均波形，高度相似性及碰撞现象共同证实两者源于同一神经元。图7B展示该细胞自发放电最大通道的短暂记录片段，图7C显示重构脉冲序列𝑆̂(𝑡)及其峰值检测结果（红圈）。通过多通道优化整合，脉冲序列信噪比较单通道提升2.2倍（13.9 vs 6.3），这与先前研究结论一致。
图6. 使用SiNAPS-NHP探针记录锥体束刺激引发的逆向响应。A，伪彩图显示1024通道SiNAPS-NHP探针各通道在锥体束刺激后的平均响应。初始刺激伪迹之后是场电位。在某些通道的场电位上叠加有逆向放电响应。通道编号越小表示在组织中的深度越深。B，与（A）相同的扫描信号，但经过文中所述的重新参考处理。刺激伪迹的持续时间缩短，场电位被消除，使得逆向放电更容易被观察到。（A）和（B）使用相同的色标。C，D，对应于（A, B）中黑框所示通道在锥体束刺激后的平均响应。扫描信号按通道的相对几何排列排列。（C）显示如（A）中的原始记录数据，（D）显示如（B）中的重新参考数据。E，对于（D）中*标记的通道，在202次扫描中有187次在刺激后约1.1毫秒出现响应，这些响应的单次扫描叠加图。F，与（E）相同，但显示202次扫描中在1.1毫秒附近无响应的15次扫描。叠加的红色轨迹是（E）中响应的平均值，用于对比。G，（E）中响应峰值潜伏期的直方图。
图7. 逆向识别锥体束神经元的自发放电提取。（A）图6所示细胞的逆向放电波形平均图（红色）与一自发放电细胞的波形平均图（黑色）叠加显示。各通道波形的高度相似性证实它们源于同一神经元。（B）从具有最大放电幅度的通道（A中*标示）采集的1秒示例记录。（C）通过多通道脉冲滤波器提取的示例脉冲波形，检测到的峰值以红色圆圈标出。
05.电极漂移校正
若记录状态稳定，采用上述方法提取锥体束神经元自发放电时间较为直接。然而在清醒行为猴中进行约一小时的SiNAPS-NHP探针记录时，常观察到信号沿探针垂直上移的漂移现象（图8），这可能源于探针植入后邻近脑组织逐渐从机械应力中松弛。
图示案例中，实验初期采集的逆向响应可清晰识别某锥体束神经元（图8A）；一小时后根据相同的逆向潜伏期与跨通道波形，可确认同一细胞已沿探针上移约五行（图8B）。为校正此类漂移，我们假设放电波形不变仅发生整数行位移，通过计算不同位移量下的滤波器组并提取对应脉冲序列估计值𝑆̂(𝑡)进行补偿。图8C显示不同位移量对应的脉冲序列峰值高度：记录初期零位移时峰值与噪声分离明显（图8C红框），提取的单元波形一致（图8D红色），峰间隔直方图在1毫秒内无区间（图8E红色），符合神经元不规则期特征。
记录至611秒时零位移峰值骤降，但上移一行后的脉冲序列仍保持清晰峰值（图8D绿色）；至823秒需进一步上移两行（图8E蓝色）。三段峰间隔直方图整体一致，但首段3毫秒处出现其他段落未见的窄峰（可能源于探针穿刺初期神经元树突损伤引发的簇状放电），推测细胞膜修复后此类损伤放电即终止。
图8. 长时程记录中的漂移检测与追踪。（A）实验开始时和（B）一小时后记录的平均逆向响应。注意可见逆向放电的通道发生明显漂移。（C）整个记录期间脉冲波形峰值高度（对应图7中红色圆圈）。各子图显示将脉冲滤波器相对于原始出现逆向放电的通道进行数行上移（正偏移）或下移（负偏移）后的结果。脉冲高度的突变对应探针与组织间的相对位移。记录分为三段，分别采用无偏移（红色，段1）、上移一行（绿色，段2）和上移三行（蓝色，段3）的方式选取脉冲。（D）对应颜色编码段的放电波形和（E）峰间隔直方图。（A, B, D）中的波形显示使用相同的通道编号。
从记录文件开始到结束，为有效识别脉冲序列总共需要三行的偏移量，但采用四行偏移也能达到同等分离效果（图8C顶部）。这与基于图8B中逆向响应推测的五行偏移量存在差异，可能源于任务相关活动记录结束与第二次逆向响应测量文件开始之间存在额外漂移。通常猴子在长时间专注任务后会出现姿势调整，此时极有可能发生组织与探针间的相对位移。
四、结论
本研究设计并制造的新型CMOS探针显著提升了清醒行为猴大脑皮层记录的技术水平。高通道数全采样特性实现了宽深度范围内大量神经元的同步记录。此外，本文提出的逆向激活识别方法可精准鉴定特定神经元亚群（如运动皮层中投射至脊髓的输出神经元），这对解析皮层网络计算机制具有关键意义。SiNAPS-NHP探针可视为灵长类神经生理学研究工具的重要突破。
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